1.什么是細(xì)胞全能性?
細(xì)胞全能性（celltotipotency）比較權(quán)威的定義是1984年國(guó)際組織培養(yǎng)協(xié)會(huì)做出的：“細(xì)胞全能性為細(xì)胞的某種特征，有這種能力的細(xì)胞保留形成有機(jī)體所有細(xì)胞類型的能力”。這個(gè)定義比一般所說的概念“一個(gè)細(xì)胞中包含著這種生物的全部遺傳信息（基因），在適當(dāng)?shù)臈l件下可以發(fā)育成一個(gè)完整的生物體”更基本和全面。它不但包含了培養(yǎng)細(xì)胞再生成植株的情況（分化成各種類型的細(xì)胞，并以一定形式構(gòu)建成植物），同時(shí)也包含了培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝物的情況（不分化或只分化成某種類型細(xì)胞，但仍留著分化為其他細(xì)胞類型的能力）。前者成為組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因植物需要進(jìn)行植株再生的理論基礎(chǔ)，后者成為像微生物發(fā)酵一樣培養(yǎng)細(xì)胞，生產(chǎn)人們所需要的次生代謝產(chǎn)物的理論基礎(chǔ)，如通過紅豆杉的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇。
2.植物組織培養(yǎng)技術(shù)是如何發(fā)展起來的？
技術(shù)和理論是一對(duì)孿生兄弟，相輔相成，技術(shù)手段的發(fā)明會(huì)促進(jìn)理論的創(chuàng)新，理論的創(chuàng)新又會(huì)指導(dǎo)技術(shù)的實(shí)踐活動(dòng)。植物組織培養(yǎng)也是如此。
早在1902年，哈伯蘭特（Haberlandt）提出高等植物的器官和組織可以不斷地分割，直至單個(gè)細(xì)胞的觀點(diǎn)，預(yù)言植物體細(xì)胞在適宜的條件下，有發(fā)育成完整植株的潛力，提出了植物細(xì)胞全能性的設(shè)想，并且用植物細(xì)胞組織進(jìn)行了培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。他雖然未能獲得再生植株，卻是植物組織培養(yǎng)的開創(chuàng)者。1902年他發(fā)表了著名論文《植物細(xì)胞離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)》，論文中提出的植物細(xì)胞全能性的理論是植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)。
從哈伯蘭特提出植物細(xì)胞全能性的理論，到1958年斯圖爾德（F.C.Steward）等人第一次用胡蘿卜根的韌皮部細(xì)胞證實(shí)了植物細(xì)胞的全能性，用了整整56年。56年中許多科學(xué)家做的事情歸納起來都是在探索哈伯蘭特提出的“植物細(xì)胞在適宜條件下，有發(fā)育成完整植株的潛力”中的適宜條件。
20世紀(jì)60年代以后，植物組織培養(yǎng)進(jìn)入了迅速發(fā)展階段，并逐步走向生產(chǎn)應(yīng)用，如快繁脫毒、單倍體育種、種質(zhì)資源保存、生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物等，也為人工種子、細(xì)胞融合、轉(zhuǎn)基因植物等奠定了基礎(chǔ)。
3.怎樣制備胡蘿卜培養(yǎng)基（供參考）？
�。�1）誘導(dǎo)胡蘿卜愈傷組織
在MS培養(yǎng)基［注］中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的6-BA和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5mg/L的NAA
�。�2）誘導(dǎo)胡蘿卜叢芽
在MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mg/L的KT和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2mg/L的NAA
�。�3）誘導(dǎo)胡蘿卜生根
在1/2MS培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1mg/L的NAA
［注］：MS培養(yǎng)基的配制方法見《選修1附錄3中八》。
4.植物組織培養(yǎng)中的愈傷組織是如何形成及再分化的？
植物組織培養(yǎng)中使用的外植體一般是高度分化了的細(xì)胞，在植物體中是不會(huì)再分裂繁殖的，只是執(zhí)行某種功能直至死亡。這些細(xì)胞在培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)會(huì)由原來的分化狀態(tài)，變成分生狀態(tài)的細(xì)胞，分裂產(chǎn)生愈傷組織，這個(gè)過程稱為脫分化（dedifferentiation）過程。這種轉(zhuǎn)變?cè)诩?xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化上都會(huì)產(chǎn)生一系列變化。組織培養(yǎng)的研究結(jié)果表明分化細(xì)胞的脫分化需要兩個(gè)條件，即創(chuàng)傷和外源激素。
目前人們對(duì)于脫分化過程的本質(zhì)還不清楚。分化細(xì)胞在細(xì)胞周期中是處于一種相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞（G0期細(xì)胞），脫分化是要打破這種狀態(tài)，使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期中的G1期，并沿著G1期→S期→G2期→M期的循環(huán)進(jìn)行細(xì)胞分裂，形成愈傷組織�，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期受基因調(diào)控，一種稱為編碼細(xì)胞周期依賴性激酶CDK（cycilindependentkinase）的基因和一種細(xì)胞周期蛋白（cyclin）可能與植物細(xì)胞脫分化的第一次分裂啟動(dòng)有關(guān)。那么，什么因素誘導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控基因的作用，培養(yǎng)實(shí)踐證明與外源激素有關(guān)。至于激素如何誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)作用的過程目前仍不清楚，有待深入研究。分化細(xì)胞脫分化后細(xì)胞結(jié)構(gòu)有兩點(diǎn)明顯的變化：一是在細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)液泡蛋白；二是葉綠體轉(zhuǎn)變成原質(zhì)體。
當(dāng)細(xì)胞脫分化形成愈傷細(xì)胞后，經(jīng)過一段時(shí)期的分裂，細(xì)胞群體變成不是一種細(xì)胞類型的均一群，又會(huì)產(chǎn)生分化，形成分生細(xì)胞或分生細(xì)胞團(tuán)，由此再生成植株有兩條途徑：一是形成體細(xì)胞胚（功能類似于受精過程產(chǎn)生的胚），通過體細(xì)胞胚形成再生植株。二是走器官發(fā)生的途徑再生植株，分生細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件下重建芽的分生組織，分化出芽后再生根，成為完整的植株。
5.為什么要在避光條件下培養(yǎng)愈傷組織？
對(duì)于植物組織培養(yǎng)來說，光照條件非常重要，包括光照強(qiáng)度、時(shí)間和波長(zhǎng)。但在愈傷組織的誘導(dǎo)階段往往要暗培養(yǎng)，而在分化再生的過程中一定要有光照。愈傷組織誘導(dǎo)階段的暗培養(yǎng)有利于細(xì)胞的脫分化產(chǎn)生愈傷組織，如果在光照條件下容易分化產(chǎn)生維管等組織，不利于產(chǎn)生大量的愈傷組織。
6.什么是人工種子？
人工種子（artificialseed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，外面包被著特定的物質(zhì)，在適宜的條件下可以發(fā)芽成苗的植物幼體。人工種子的概念中包含的“具有正常發(fā)育能力的材料”通常是指胚狀體（目前國(guó)外有使用不定芽、頂芽和腋芽的），它可以由三種途徑產(chǎn)生：
�。�1）由已脫分化的外植體直接產(chǎn)生；
�。�2）由愈傷組織產(chǎn)生；
�。�3）由懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生。對(duì)胚狀體的基本要求是：①播種后能快速出苗；②根和芽幾乎同時(shí)生長(zhǎng)，不產(chǎn)生愈傷組織；③同步化程度高；④活力強(qiáng)；⑤形成的幼苗的形態(tài)與生長(zhǎng)要常。
“外面包被著特定的物質(zhì)”是指人工種皮，制作人工種皮的材料有海藻酸鈉、明膠、樹脂、瓊脂糖、淀粉等。對(duì)人工種皮的要求是：能保持胚狀體的活力，有利于貯藏運(yùn)輸和萌發(fā)。選取的材料要有韌性，耐壓，對(duì)胚狀體無毒害，含有胚狀體發(fā)芽所需要的營(yíng)養(yǎng)成分或植物激素，還應(yīng)含有殺菌劑，以防播種后微生物的侵害。
人工種子目前還存在不少問題。例如，現(xiàn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物產(chǎn)生胚狀體能力弱，難以形成同步化的有強(qiáng)活力的胚狀體；成本較高；運(yùn)輸貯藏以及機(jī)械化播種問題也未解決。因此，現(xiàn)在很少有人以生產(chǎn)為目的進(jìn)行人工種子的研制。
7.植物微型繁殖技術(shù)高效快速的實(shí)例有哪些？
植物脫毒（virus-free）和離體快繁（invitropropagation）是目前植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最有效的方面。生產(chǎn)上許多無性繁殖作物均受到病毒的侵染，從而導(dǎo)致品種的嚴(yán)重退化、減產(chǎn)和降低品質(zhì)。利用植物分生組織進(jìn)行培養(yǎng)可以使新長(zhǎng)成的植株脫去病毒。利用這種方法生產(chǎn)無病毒苗的農(nóng)作物有馬鈴薯、甘薯、大蒜、草莓、蘋果、香蕉等，并已大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。離體快繁技術(shù)可以使一些植物的擴(kuò)增速度比常規(guī)方法快數(shù)萬倍乃至百萬倍，而且產(chǎn)生的幼苗遺傳背景均一，重復(fù)性好，不受季節(jié)和地區(qū)限制。目前世界上已建成很多年產(chǎn)百萬苗木的組培工廠，成為一種新興產(chǎn)業(yè)。離體快繁技術(shù)在觀賞植物、園藝植物、經(jīng)濟(jì)林木和無性繁殖作物上已得到廣泛應(yīng)用。
8.植物體細(xì)胞雜交的過程是怎樣的？
體細(xì)胞雜交是克服植物有性雜交不親和性、打破物種之間的生殖隔離、擴(kuò)大遺傳重組范圍的一種手段。操作過程包括：原生質(zhì)體制備、原生質(zhì)體融合、雜種細(xì)胞篩選、雜種細(xì)胞培養(yǎng)、雜種植株再生以及雜種植株鑒定等步驟。
原生質(zhì)體制備是用纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶將植物細(xì)胞壁分解掉，只留下細(xì)胞膜（質(zhì)膜）包裹著細(xì)胞內(nèi)含物。原生質(zhì)體融合是指兩個(gè)原生質(zhì)體的質(zhì)膜重新組合排列形成一個(gè)質(zhì)膜，其中含有兩個(gè)細(xì)胞核。在細(xì)胞工程中一般是誘導(dǎo)融合，形成的融合細(xì)胞中所含有的兩個(gè)細(xì)胞核是來自不同的物種，稱之為異核體（heterokaryon）。誘導(dǎo)融合的手段有化學(xué)誘導(dǎo)和物理誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)因素的作用下形成的融合細(xì)胞進(jìn)一步產(chǎn)生核融合，進(jìn)行第一次有絲分裂。雜種細(xì)胞的篩選方法有：①細(xì)胞系互補(bǔ)的選擇方法，包括葉綠素缺失互補(bǔ)、營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ)和抗性互補(bǔ)等；②利用物理特異性差異的選擇方法：這是利用兩個(gè)原生質(zhì)體物理特異性差異的一種選擇，包括原生質(zhì)體的大小、顏色、浮密度等的不同來選擇；③利用生長(zhǎng)特異性差異的選擇方法。需要注意的是上述選擇方法只適合部分雜交細(xì)胞的情況，有時(shí)無法選擇，就不加選擇地進(jìn)行培養(yǎng)和再生成植株，然后對(duì)再生植株的雜種性狀進(jìn)行鑒定。雜種細(xì)胞培養(yǎng)方法與原生質(zhì)體的培養(yǎng)方法相似。體細(xì)胞雜種的鑒定方法有：①形態(tài)學(xué)鑒定。利用雜種植株與雙親在表現(xiàn)型上的差異進(jìn)行比較分析，如葉片大小與形狀，花的形狀與顏色、葉脈、葉柄、花梗及表皮毛有無等；②細(xì)胞學(xué)鑒定。雜種植株細(xì)胞中的染色體數(shù)目是否比任何一方親本細(xì)胞中的染色體數(shù)目增多？理論上講如果染色體不丟失，雜種細(xì)胞中染色體數(shù)目應(yīng)為雙親染色體數(shù)目之和。也可以用基因組原位雜交的分子細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行鑒定；③同功酶鑒定。同功酶是功能相同的酶的多重分子形態(tài)，它們是特異基因的產(chǎn)物。雜種細(xì)胞中的同功酶譜一般是雙親酶譜之和，但有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)雙親沒有的新帶；④分子生物學(xué)鑒定。常用的方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（RAPD）和擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）等。
值得注意的是體細(xì)胞雜交尚存在一些問題：①親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，染色體排斥丟失的現(xiàn)象就越嚴(yán)重；②由于是兩個(gè)物種的全部遺傳物質(zhì)的合并，各種基因都在其中，選擇符合需要的個(gè)體難度大；③有時(shí)缺乏選擇雜種細(xì)胞的有效方法。因此目前整體對(duì)稱融合的工作比較少，而是采用非對(duì)稱融合，即一方親本包括了全部遺傳物質(zhì)，另一方親本只取一部分遺傳物質(zhì)，如用不具有核的原生質(zhì)體與之進(jìn)行融合。
9.物理和化學(xué)方法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的基本原理是什么？
化學(xué)融合的機(jī)制：常用化學(xué)融合方法有高pH—高Ca2+法和聚乙二醇（PEG）法。高pH—高Ca2+法誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的基本原理是中和原生質(zhì)體表面所帶的電荷，使原生質(zhì)體的質(zhì)膜緊密接觸，從而有利于質(zhì)膜的接觸融合。PEG處理原生質(zhì)體可以使原生質(zhì)體聚集促進(jìn)融合，但PEG誘導(dǎo)融合的真正機(jī)制目前并不清楚。
物理融合的機(jī)制：常用方法為電融合法。此法是先將兩種原生質(zhì)體以適當(dāng)?shù)谋壤旌铣蓱腋∫�，將其滴入電融合小室中，給小室兩極以交變電流，使原生質(zhì)體沿電場(chǎng)方向排列成串珠狀，接著給以瞬間高強(qiáng)度的電脈沖，使原生質(zhì)體膜產(chǎn)生局部破損而導(dǎo)致融合。
10.工廠化生產(chǎn)人參皂甙的基本過程是什么？
第一步，選擇人參根作為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)過培養(yǎng)選擇找到增殖速度快而且細(xì)胞內(nèi)人參皂甙含量高的細(xì)胞株作為種質(zhì)，其中一部分作為保存用，以備下一次生產(chǎn)用，一部分進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。
第二步，將第一步選擇到的細(xì)胞株在發(fā)酵罐中的適合培養(yǎng)液中進(jìn)行液體培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量。
第三步，將發(fā)酵罐中培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行破碎，從中提取人參皂甙。
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